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SPA夾心ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CIC

2015-02-11昀冠科學(xué)商城新聞編輯

金黃色葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A，SPA）可與IC中IgG的Fc段結(jié)合。將待測(cè)血清用低濃度PEG沉淀后加至SPA包被的固相載體上，再以酶標(biāo)記的SPA與之反應(yīng)，即可檢測(cè)樣本中有無(wú)IC。

1、試劑

（1）5%與2.5%PEG用0.02mol/LpH7.4PBS配制；

（2）牛血清白蛋白（BSA）緩沖液：用0.05mol/L pH 7.4PBS配制。含0.01mol/L EDTA、0.1%硫柳汞、0.05%Tween 20及4%BSA；

（3）HRP-SPA用改良過(guò)碘酸鈉法將SPA與辣根過(guò)氧化物酶（HRP）制成結(jié)合物，最適工作濃度以方陣法滴定；

（4）熱聚合人IgG：人IgG 10mg/ml，63℃加熱20min制成。

2、操作步驟

（1）用PBS稀釋SPA成5Ps/ml，包被聚苯乙烯反應(yīng)板微孔，每孔0.1ml（對(duì)照孔不包被），置4℃過(guò)夜后洗滌3次備用；

（2）待測(cè)血清0.05ml加PBS0.15ml和5%PEG0.2ml混勻，4℃過(guò)夜后1600r/min離心20min，棄上清，沉淀用2.5%PEG洗2次，加入PBS0.2ml和BSA緩沖液0.2ml，混勻，置37℃水浴30min，搖動(dòng)，使完全溶解；

（3）將已溶解的待測(cè)血清沉淀物加至上述包被孔和對(duì)照孔中，置37℃60min，洗3次；各孔加底物溶液（OPD—H₂0₂）0.1ml，37℃ 20min使呈色。每孔加2mol/LH₂S0₄1滴終止反應(yīng)。置酶標(biāo)儀492nm測(cè)各孔吸光值；

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：取正常人血清0.2ml，加熱聚合人IsC（120ug/ml）0.2ml，再加PBS0.4ml和5%PEG0.8ml，置4℃過(guò)夜。同時(shí)做不加熱聚合人耽的正常血清對(duì)照，以排除血清中干擾因素。沉淀清洗同標(biāo)本操作。用稀釋的BSA緩沖液（加等量0.01mol/LpH7.4PBS）1.6ml溶解并稀釋成120、60、30、15、7.5ug/ml，與待測(cè)血清同法操作，制成工作標(biāo)準(zhǔn)曲線；

（5）結(jié)果判斷：從待測(cè)血清吸光度值查標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可換算成相當(dāng)于熱聚合人IgG的CIC含量（ug/ml）。以高于正常對(duì)照X+2S，即大于28.4ug/ml為陽(yáng)性。

3、注意事項(xiàng)

（1）熱聚合人IgC應(yīng)分裝貯存于-20℃，不宜反復(fù)凍融，否則易解聚；

（2）PEG的濃度影響CIC沉淀量，須嚴(yán)格配制。